警告：實驗中使用的部分溶劑及標準品具有一定的毒性，試劑配制和樣品前處理過程應在通風櫥中進行，操作時應按規定要求佩戴防護器具，避免接觸皮膚和衣物。
1 適用范圍
本標準規定了測定水中草甘膦的高效液相色譜法。
本標準適用于地表水、地下水、生活污水和工業廢水中草甘膦的測定。
當進樣體積為 20 μl 時，方法的檢出限為 2 μg/L，測定下限為 8 μg/L。
2 規范性引用文件
本標準引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本標準。
HJ 91.1 污水監測技術規范
HJ/T 91 地表水和污水監測技術規范
HJ/T 164 地下水環境監測技術規范
3 方法原理
樣品在 pH 為 4～9 的條件下加入二水合檸檬酸三鈉，經過濾或固相萃取凈化后與 9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC-Cl）進行衍生化反應，生成的熒光產物經二氯甲烷萃取凈化去除衍生化副產物后，用具有熒光檢測器的高效液相色譜分離檢測。以保留時間和特征波長定性，外標法定量。
4 干擾和消除
樣品中的金屬離子會與草甘膦形成穩定的絡合物從而干擾草甘膦的測定，可通過加入二水合檸檬酸三鈉消除干擾。
5 試劑和材料
除非另有說明，分析時均使用符合國家標準的分析純試劑，實驗用水為無目標化合物檢出的去離子水。
5.1 乙腈（CH3CN）：色譜純。
5.2 甲醇（CH3OH）：色譜純。
5.3 二氯甲烷（CH2Cl2）：色譜純。
5.4 鹽酸：ρ（HCl）=1.19 g/ml，優級純。
5.5 磷酸：ρ（H3PO4）=1.69 g/ml，優級純。
5.6 氫氧化鈉（NaOH）。
5.7 鹽酸溶液：1+1。
量取50 ml鹽酸（5.4），緩慢加入到50 ml水中。
5.8 氫氧化鈉溶液：c（NaOH）＝0.1 mol/L。
稱取0.4 g氫氧化鈉（5.6）溶于少量水中，定容至100 ml。
5.9 磷酸溶液：φ（H3PO4）=0.2%。
取2.0 ml磷酸（5.5）于1000 ml容量瓶中，用水稀釋定容至標線，混勻。
5.10 二水合檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O）。
5.11 十水合四硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O）。
5.12 四硼酸鈉溶液：c（Na2B4O7）=0.05 mol/L。
稱取 1.91 g 十水合四硼酸鈉（5.11）溶于少量水中，定容至 100 ml。
5.13 9-芴甲基氯甲酸酯（C15H11ClO2）標準品：純度不低于99.0%，4℃以下避光冷藏。
5.14 9-芴甲基氯甲酸酯乙腈溶液：ρ（C15H11ClO2）=1000 mg/L。
稱取50 mg 9-芴甲基氯甲酸酯標準品（5.13），用少量乙腈（5.1）溶解，轉移至50 ml容量瓶中，用乙腈（5.1）稀釋定容至標線，混勻。4℃以下避光冷藏，保質期3個月。
5.15 草甘膦（C3H8NO5P）標準品：純度不低于99.0%，4℃以下避光冷藏。
5.16 草甘膦標準貯備液：ρ（C3H8NO5P）=1000 mg/L。
準確稱取50.0 mg草甘膦標準品（5.15），溶于少量水中，轉移至50 ml容量瓶中，用水稀釋定容至標線，混勻。4℃以下避光冷藏，保質期6個月，或直接購買有證標準溶液。
5.17 草甘膦標準使用液：ρ（C3H8NO5P）=10.0 mg/L。
移取適量草甘膦標準貯備液（5.16），用水稀釋，配制濃度為10.0 mg/L的草甘膦標準使用液。4℃以下避光冷藏，保質期2個月。
5.18 濾膜：0.45 μm，親水性聚丙烯、玻璃纖維、親水性聚四氟乙烯或其他等效材質。
6 儀器和設備
6.1 高效液相色譜儀（HPLC）：具有熒光檢測器。
6.2 色譜柱：填料粒徑為5 μm，柱長250 mm，內徑4.6 mm的十八烷基鍵合硅膠（C18）反相色譜柱，或其它性能相近的色譜柱。
6.3 固相萃取柱：填料為二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物或十八烷基硅膠的萃取柱， 或同等柱效的萃取柱，規格為500 mg/6 ml。
6.4 聚乙烯塑料（PE）管：10 ml。
6.5 水平振蕩器。
6.6 渦旋振蕩器。
6.7 棕色采樣瓶：250 ml或500 ml帶聚四氟乙烯襯墊的螺旋蓋玻璃瓶或磨口瓶。
6.8 棕色樣品瓶：2.0 ml帶聚四氟乙烯襯墊的螺旋蓋玻璃瓶。
6.9 一般實驗室常用儀器和設備。
7 樣品
7.1 樣品采集和保存
按照 HJ 91.1、HJ/T 91 和 HJ/T 164 的相關規定進行樣品的采集。
用棕色采樣瓶（6.7）采集樣品，樣品滿瓶采集。若采集的樣品 pH 不在 4～9 之間，用鹽酸溶液（5.7）或氫氧化鈉溶液（5.8）調節其 pH 至 4～9，4℃以下冷藏、避光保存，7 d 內完成樣品分析工作。
7.2 試樣的制備
7.2.1 固相萃取凈化
依次用 6 ml 甲醇（5.2）和 6 ml 水活化固相萃取柱（6.3），保證小柱柱頭浸潤。量取10 ml 樣品，加入 29.3 mg 二水合檸檬酸三鈉（5.10），混勻后以約 3 ml/min（約 1 滴/秒） 的流速通過固相萃取柱，收集凈化后的樣品，待衍生。
注 1：對于清潔度較好的，對目標化合物測定沒有明顯干擾的樣品，可加入二水合檸檬酸三鈉（5.10） 后直接經濾膜（5.18）過濾，待衍生。
注 2：若樣品濃度較高，先將樣品稀釋后加入二水合檸檬酸三鈉（5.10）再進行固相萃取凈化，待衍生。
7.2.2 衍生化反應
取 2.00 ml 凈化后的樣品于聚乙烯塑料（PE）管（6.4）中，加入 0.50 ml 四硼酸鈉溶液（5.12），1.00 ml 9-芴甲基氯甲酸酯乙腈溶液（5.14），充分混勻后置于水平振蕩器（6.5） 上，40℃下衍生 1 h。
7.2.3 液液萃取凈化
在衍生后的樣品中加入 5 ml 二氯甲烷（5.3），置于渦旋振蕩器（6.6）上渦旋萃取 2 min， 取水相層，經濾膜（5.18）過濾，收集 1 ml 濾液于棕色樣品瓶（6.8）中，待測。
7.3 空白試樣的制備
用實驗用水代替樣品，按照與試樣的制備（7.2）相同步驟進行實驗室空白試樣的制備。
8 分析步驟
8.1 液相色譜參考條件
流動相A：乙腈（5.1），流動相B：磷酸溶液（5.9），梯度洗脫程序見表1；
流速：1.0 ml/min；
柱溫：30℃；
進樣量：20 μl；
激發波長：254 nm；
發射波長：以302 nm作為檢測波長，以315 nm作為輔助定性波長。
表 1 梯度洗脫程序
時間（min） | 流動相 A（%） | 流動相 B（%） |
0 | 35 | 65 |
10 | 25 | 75 |
15 | 80 | 20 |
20 | 35 | 65 |
25 | 35 | 65 |
注：15 min～20 min用于清洗色譜柱，清洗時間可根據實際樣品的復雜程度進行調整。20 min～25 min為色譜柱的平衡時間。 | ||
8.2 工作曲線的建立
分別取適量的草甘膦標準使用液（5.17），用水稀釋，制備至少5個濃度點的標準系列，草甘膦的質量濃度分別為0 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、500 μg/L（此為參考濃度）。
按7.2.2步驟進行衍生化反應，按7.2.3步驟液液萃取凈化，然后按儀器參考條件（8.1），由低濃度到高濃度依次對標準系列溶液進樣，以草甘膦的濃度為橫坐標，對應的色譜峰面積或峰高為縱坐標，建立工作曲線。
8.3 試樣測定
按照與工作曲線的建立（8.2）相同的儀器條件進行試樣（7.2）的測定。
8.4 空白試驗
按照與試樣測定（8.3）相同的儀器條件進行空白試樣（7.3）的測定。
9 結果計算與表示
9.1 定性分析
根據樣品中目標化合物的保留時間定性，必要時可采用標準加入法、不同波長下的熒光強度比值等方法輔助定性。
在本標準推薦的液相色譜參考條件（8.1）下，100 μg/L 草甘膦溶液對應的衍生物標準色譜圖見圖 1。
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