1. 項目背景
1.1 任務來源
近年來，土壤環境中抗生素的污染問題受到研究人員、政府部門和大眾的廣泛關注。廣東省政府對土壤中抗生素的污染非常重視，為配合貫徹《廣東省土壤污染防治行動計劃實施方案》，規范土壤環境中抗生素的檢測方法，特制定本標準。
根據《廣東省市場監督管理局關于批準下達省地方標準制修訂計劃項目的通告》(2019 年第 7 號)，廣東省環境監測中心、華南師范大學環境研究院負責起草《土壤 抗生素類化合物的測定 超聲提取-固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法》。
1.2 工作過程
1.2.1 成立標準編制工作小組
根據 2019 年 1 月 7 日發布的《廣東省市場監督管理局關于批準下達省地方標準制修訂計劃項目的通告》(2019 年第 7 號)，廣東省環境監測中心和華南師范大學環境研究院接到制定《土壤 抗生素類化合物的測定 超聲提取-固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法》的任務后，成立標準編制工作小組，由從事多年抗生素研究經驗、熟悉樣品前處理、液相色譜-質譜聯用儀的技術人員承擔本工作。
1.2.2 查詢國內外相關標準和文獻資料
2019 年 1 月，標準編制工作組根據有關標準制修訂工作管理辦法的相關規定， 檢索、查詢和收集國內外相關標準和文獻資料。調研發現，國內外抗生素的檢測方法有微生物法、酶聯免疫吸附法、氣相色譜法、毛細管電泳檢測技術法、液相色譜法、液相色譜與質譜聯用技術等。微生物法和酶聯免疫吸附法等檢測技術存在費時、抗體制備不易、敏感性差、假陽性率高等缺點；氣相色譜法和毛細管電泳檢測技術則受限于抗生素的非揮發或熱不穩定性以及不同環境中電荷性質的差異性等而不適宜于抗生素的大量檢測。近來越來越多的文獻研究結果表明，高效液相色譜-串聯質譜法(以下簡稱 LC-MS/MS)是一種高效、準確和靈敏的抗生素檢測方法。但是，目前國內暫無采用 LC-MS/MS 測定土壤環境中抗生素的相關標準。
1.2.3 確定標準制訂技術路線，制訂原則
2019 年 1 月至 3 月，確定了本標準的具體內容、原則、技術路線等內容。根據我國抗生素的使用量、土壤中常見抗生素的檢出情況等資料，確定了我國常用的 17 種抗生素為目標物質，包括 6 種磺胺類、2 種氟喹諾酮類、5 種大環內酯類、2 種四環素類、林可霉素和甲氧芐氨嘧啶，采用超聲輔助提取-固相萃取柱凈化-LC-MS/MS 法分析的技術方案，實現對不同性質土壤中痕量抗生素的高效、準確測定。
1.2.4 實驗室內部方法開發
2019 年 4 月至 9 月，標準編制組采用超聲輔助提取-固相萃取柱凈化-LC-MS/MS 分析的方法，在華南師范大學環境研究院廣東省化學品污染與環境安全重點實驗室內部開展了檢出限、精密度、準確度、方法適用性等系列的方法開發工作。實驗結果表明，當土壤干重為 2.0 g，經提取、凈化和濃縮后定容體積為 1.0 ml，進樣體積
為 10μl 時，17 種抗生素的方法檢出限為 0.6μg/kg～ 4.7μg/kg，測定下限為 2.4μg/kg ～19 μg/kg。可實現土壤中痕量抗生素的定量分析。
1.2.5 編寫標準文本和編制說明初稿
2019 年 10 月至 12 月，標準編制工作小組匯整前期研究成果，編寫標準草案及編制說明。
1.2.6 開展方法驗證工作
2020 年 5 月至 8 月，標準編制工作組確定了外部 6 家實驗室進行方法驗證，于2020 年 9 月收回全部的驗證報告，在此基礎上進行了數據的匯總和分析整理工作， 并編寫完成了驗證匯總報告。
1.2.7 編寫標準文本（征求意見稿）和編制說明
2020 年 9 月至 11 月，標準編制工作組編寫《土壤 抗生素類化合物的測定 超聲提取-固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法（討論稿）》的標準文本及編制說明， 并于 2020 年 11 月 3 日組織專家對標準文本（討論稿）及編制說明進行了初步論證。根據專家意見進一步修改，形成標準文本（征求意見稿）及編制說明。
2 標準制修訂的必要性
2.1 目標污染物的環境危害
2.1.1 目標污染物的基本性質
抗生素是由微生物(細菌、真菌和放線菌) 在生長代謝過程中產生或由人工合成或半合成的，能抑制微生物生長的小分子化合物。由于抗生素在人類臨床疾病治療和畜牧水產業中的廣泛應用，自 1929 年英國科學家弗萊明發現青霉素以來，隨著科技的進步，不斷有新的抗生素被發現或合成，抗生素隊伍得以不斷壯大，至今已達上萬種，不僅包括微生物產生的，也包括高等動植物產生的代謝物以及用化學方法合成和半合成的化合物；不僅包括抗細菌的物質，也包括抗腫瘤、抗原蟲、抗病毒、抗真菌、抗藻類、抗寄生蟲等的物質。
目前常見的抗生素類型主要有：
(1) 磺胺類：磺胺類藥物是應用最早的一類人工合成抗菌藥物。磺胺類藥物屬于 廣譜抗菌藥物，因其抗菌譜廣、療效強、方便安全等優點被廣泛用于人體和動物(各 種畜禽、水產和寵物) 。常見的磺胺類藥物主要有磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、復方新諾明(磺胺甲噁唑+甲氧芐氨嘧啶) 等。磺胺的分子中含有一個苯環，一個對位氨基和一個磺酰胺基。磺胺類化學物主要是 通過各種化學基團來取代磺酰胺基上的氫原子制備的有效衍生物(圖 1)。
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??圖 1 主要的抗生素種?
類(2) 四環素類：四環素是一類被廣泛使用的廣譜抗生素，能通過與核糖體 30S 亞基結合，阻止氨酰-tRNA 與核糖體結合而抑制細菌蛋白質的合成。四環素類抗生素可與 Ca2+、Mg2+、Fe2+和 Al3+等金屬離子形成絡合物，影響藥效。同時與 Ca2+形成的不溶絡合物會影響小兒的牙齒變黃和骨骼發育，因此小孩和孕婦禁用四環素類抗生素。常見的四環素類抗生素有金霉素、土霉素、強力霉素、甲烯土霉素、甘氨酰環素等。目前，四環素類抗生素多用于養殖業，如養豬、養雞和水產養殖等。
(3) 喹諾酮類：喹諾酮類藥物是一類 4-氧-1,4-二氫喹諾酮為原始骨架的人工合成抗生素。喹諾酮類藥物通過在 DNA 解鏈階段俘獲細菌型 IIA 拓撲異構酶、DNA 旋轉酶和拓撲異構酶 IV 而對染色體拓撲異構化產生干擾，阻滯 DNA 單鏈部分的復性，從而抑制細菌 DNA 的復制而發揮抑菌作用。自 20 世紀 60 年代萘啶酸、吡咯酸、惡喹酸等的發現開始，喹諾酮藥物已發展至第四代，抗菌活性逐漸增強，副作用降低。現已被廣泛用于人畜疾病治療，常用的主要為第三代喹諾酮類，如環丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾氟沙星和培氟沙星等。該類物質相對較穩定，水溶性偏低。
(4)β-內酰胺類：β-內酰胺類是一類含有β-內酰胺環的抗生素，其通過抑制革蘭氏陰性細菌細胞壁合成的最后一步而對細菌產生抑制作用。該類抗生素具有殺菌活性強、藥物代謝動力學性質良好、低宿主毒性以及與其它種類抗生素(例如氨基糖苷類) 協同增效等優點，因此被廣泛應運于臨床和畜牧業中。青霉素類水溶液不穩定， 極易失效；不耐熱；酸、堿、重金屬及青霉素酶可使其β-內酰胺環破裂，導致失效。常用的有青霉素、苯唑西林、氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢噻肟等。
(5)大環內酯類：大環內酯類抗生素是一類具有大環內脂結構，可抑制大多數革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的廣譜一線抗生素。大環內酯類通過與細菌核糖體 50S 亞基可逆性結合，抑制蛋白質的合成，發揮抑菌活性。常見的大環內酯類抗生素有紅霉素 A、阿奇霉素、泰樂菌素、竹桃霉素和北里霉素。
(7)多肽類：多肽類抗生素是一類具多肽結構特征的抗生素，通過作用于細菌的滲透壓屏障，損傷細胞質膜而對細菌產生抑制，可分為多黏菌素類、糖肽類和桿菌肽類。通常被用作抵抗革蘭氏陽性菌的最后一道防線。常見的多肽類抗生素有多黏菌素 B、桿菌肽、短桿菌肽、萬古霉素、替考拉寧、奧利萬星、達巴萬星、特拉萬星、氯依瑞霉素等。
(8)林可酰胺類：林可酰胺類化學結構主要由氨基酸和寡糖構成，其主要作用機制為與核糖體 50S 亞基結合抑制肽鏈的生成，主要針對厭氧細菌和原生動物感染。易引發惡心、嘔吐、腹瀉、皮疹、發燒等不良反應，很少用于臨床醫療，主要與大觀霉素聯合用于反芻動物、豬和禽類。該類抗生素中的細菌自然代謝生成的代表有林可霉素和天青霉素，其半合成的代表有克林霉素和吡利霉素。
(9)氯霉素類：氯霉素是一種對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的廣譜抗生素， 氯霉素主要抑菌機理為通過與原核細胞中 50S 核糖體亞基結合，抑制蛋白質的合成而阻止細菌繁殖。氯霉素分子主要由對硝基苯基、丙二醇與二氯乙酰胺三個部分組 成，性質穩定。氯霉素類能引發多種嚴重的副作用，例如骨髓抑制、再生性障礙貧血、血小板減少癥和粒細胞減少等，故中國、日本、加拿大、美國和澳大利亞等國 家現已明令禁止其使用。常見的氯霉素類抗生素有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考等。
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