《水質 滅菌指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的鑒定 生物學檢測法（征求意見稿）》編制說明

1 項目背景

1.1 任務來源

      2012 年 4 月，原國家環境保護部辦公廳發布了《關于開展 2012 年度國家環境保護標準制修訂項目工作的通知》（環辦函〔2012〕503 號），由上海市環境監測中心承擔《水質  指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的測定 生物學檢測法》項目的制訂工作。項目統一編號為 2012-54。

1.2 工作過程

1.2.1 成立標準編制組

      任務下達后，上海市環境監測中心作為承擔單位成立了標準編制組，成員以多年從事微生物監測工作的人員為主。

1.2.2 相關標準和文獻資料調研

      2012 年，通過國內外相關分析方法比較研究，分析總結枯草芽孢桿菌黑色變種測定的技術特點和問題、技術發展趨勢、新技術的可行性；結合相關法律、法規和政策的研究和分析，提出標準制修訂的必要性，完成標準開題論證報告和標準草案的編寫。

1.2.3 召開研討會，研究建立標準方法，開展方法研究

      按照標準制定要求，參考相關標準和資料，召開研討會，就標準編制的重難點進行討論， 最終確立實驗方案。于 2012 年～2014 年開展了標準方法研究試驗和適用性試驗。

1.2.4 開題論證，確定標準制定的技術路線和原則

      2014 年 4 月 7 日，標準開題論證報告和標準草案通過了環保部科技標準司組織的開題論證會，并提出了修改建議：將標準適用范圍確定為“含活性微生物廢水經滅菌處置后，枯草芽孢桿菌黑色變種的測定”；調整檢測方法程序，先篩查后鑒定；根據相關排放標準要求， 確定合理的樣品取樣量。

1.2.5 落實專家意見，深入開展方法試驗研究

      2014 年 5 月～2015 年 6 月，根據開題論證意見，標準編制組按照《國家環境保護標準制修訂工作管理辦法》（國家環境保護總局 2006 年第 41 號）、《環境監測 分析方法標準制修訂技術導則》（HJ 168-2010）等文件的要求開展和增加相關試驗；并準備實驗室方法驗證工作，著手編寫《水質 指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的測定 生物學檢測法》標準征求意見稿及方法驗證方案。

1.2.6 方法驗證工作

      2016 年 03 月～2016 年 6 月，組織 6 家有資質的實驗室進行方法驗證，于 2016 年 6 月收回所有的驗證報告，隨后進行了數據的匯總和整理分析工作，編制《水質 指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的測定 生物學檢測法》驗證報告。

1.2.7 標準征求意見稿和編制說明

      2016 年 6 月～2016 年 12 月，完善《水質 指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的測定 生物學檢測法》征求意見稿并編寫標準編制說明。

1.2.8 標準研討會

      2017 年 1 月 13 日，于北京召開了《水質 指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的測定 生物學檢測法》標準編制工作的研討會，經質詢和討論，形成意見：將適用范圍修改為“本標準適用于含活性微生物廢水經滅菌處置后的滅菌指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的生物學檢測”；標準文本中 3 方法原理內容建議進一步詳述；標準文本中 4 試劑和材料內容進行部分修改；標準文本的部分注解、引用等文字進行適當更正。

1.2.9 標準征求意見稿編制

      2017 年 1 月～2018 年 6 月，修改完善《水質 指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的測定 生物學檢測法》標準征求意見稿及編制說明，并進行了專家函審。

1.2.10 召開標準征求意見稿技術審查會并根據審查意見修改

      根據生態環境保護部環境監測司要求，于 2018 年 7 月 6 日召開了《水質 指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的測定 生物學檢測法》標準征求意見稿技術審查會，審查專家提出了將標準名稱改為《水質 滅菌指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的鑒定  生物學檢測法》，明確方法適用范圍，完善方法原理、干擾和消除的表述，在樣品采集中增加干擾和消除的步驟，補充芽孢染色鏡檢的描述和圖例，質量保證和質量控制中細化試劑和培養基質量控制要求等審查意見，編制組根據專家審查意見，修改標準名稱，對文本相應內容進行修改和補充。

2 標準制修訂的必要性分析

2.1 監測意義

2.1.1 枯草芽孢桿菌黑色變種基本情況

      “枯草芽孢桿菌黑色變種 Bacillus subtilis var. niger”，由美國的 Elizabeth 最先分離得到，因其在含酪氨酸的培養基上產棕黑色素而得名。1989 年，Nakamura 依據 DNA 相似性研究，提議將包括“枯草芽孢桿菌黑色變種”在內的菌株劃分為新的一個種，2001年該種被學術界承認和接受，命名為“萎縮芽孢桿菌”。

      Nakamura 將萎縮芽孢桿菌的形態特性歸納為：營養細胞桿狀，單個或短鏈狀排列，革蘭染色為陽性；細胞寬 0.5μm～1.0 μm，長 2.0μm～4.0 μm，可運動；芽孢橢圓形、中生、不膨大。生化特性包括：好氧生長，V-P 反應陽性（V-P 培養基中培養，pH 范圍為 5.3～5.7， DNA 浮力密度為 1.6946 g/cm3～1.6966 g/cm3，G+C 含量為 41 mol%～43 mol%。產過氧化氫酶，不產氧化酶、硫化氫、吲哚、二羥基丙酮；利用阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、甘露糖醇、水楊苷、蔗糖、海藻糖和木糖發酵后產酸不產氣，利用纖維二塘、半乳糖、麥芽糖、甘露糖、核糖、甲基戊糖和ft梨糖醇產酸的過程不穩定。可將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，水解淀粉和酪蛋白，利用檸檬酸鹽，消化吸收酪蛋白；不能利用丙酸鹽，不能發酵乳糖和蜜二糖，不能分解蛋黃卵磷脂、吐溫-80、尿素、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、苯基丙氨酸和酪氨酸；在石蕊牛乳中 pH 呈堿性。最適宜生長溫度為 28～30℃，最高生長溫度為 50℃～55℃，最低生長溫度為 5～10℃，在 pH 為 5.6 或 5.7，含 7%NaC1 條件下生長，在含有 0.001%的溶解酵素情況下，生長被抑制。

      而本標準為了便于國內應用與識別，仍稱“枯草芽孢桿菌黑色變種”， 其分類地位見下圖 1，代表菌株編號 ATCC 9372。

      >細菌

           >厚壁菌門

                 >桿菌

                       >芽孢桿菌目

                             >芽胞桿菌科

                                    >芽孢桿菌屬

                                           >枯草芽孢桿菌群

                                                  >枯草芽孢桿菌黑色變種

?圖1 枯草芽孢桿菌黑色變種分類地位

2.1.2 檢測意義

      枯草芽孢桿菌黑色變種作為枯草芽孢桿菌亞種，本身不具有危害性，因能產生對熱、紫外線、電離輻射和某些化學物質很強抗性的芽孢，可以作為消毒劑檢測及滅菌質量控制方面的質量控制標準菌株進行應用。

      《美國藥典》將枯草芽孢桿菌黑色變種作為干熱消毒、環氧乙烷控制的生物指示劑及用于醫藥物品消毒與無菌保證；《歐洲藥典》將其作為殺菌法的生物指示劑；我國在《中國藥典》、《消毒與滅菌效果的評價方法與標準》(GB 15981-1995)、《消毒技術規范》均將枯草芽孢桿菌黑色變種作為消毒滅菌指示微生物；英國、瑞士等國標準協會在健康產品相關的標準或與醫療器械相關的標準中已將該菌株作為環氧乙烷滅菌、干熱滅菌和其它液體化學消毒劑的指示劑。

      此外，枯草芽孢桿菌黑色變種也可作為炭疽桿菌的非致病性替代物，用于軍事等方面研究；用于生產生物表面活性劑，在環境保護、有機物質處理和油回收等領域[8]具有廣闊的應用；用于芽孢形成、萌發、耐熱機理等研究領域；在分布媒介、凈化模擬及大范圍過程開發等領域也有著重要的研究意義。美國模式培養物保藏所將枯草芽孢桿菌黑色變種菌株的作用總結為：抗性測試、效力試驗、環氧乙烷消毒、蒸汽消毒、介質測試、無菌測試及消毒控制。

      綜上所述，枯草芽孢桿菌黑色變種在消毒劑檢測及滅菌質量控制方面具有廣泛的應用，而本標準的制定，對水環境衛生安全的監測和評價十分關鍵。

2.2 相關環保標準和環境工作的需要

      醫療廢物監控的需要。為加強醫療廢水排放的管理，有效截斷各種傳染病的傳播途徑， 國務院頒布了《醫療廢物管理條例》，明確規定醫療衛生機構產生的污水、傳染病病人或者疑似傳染病病人的排泄物，應當按照國家規定嚴格消毒，達到國家規定的排放標準，主要污染物應嚴格執行《污水綜合排放標準》（GB 8978-1996）才可排放。《全國危險廢物和醫療廢物處置設施建設規劃》第二章技術要求中指出，“小于 10 噸/日的醫療廢物處置設施，必須做到殺菌、滅活、毀形和無害化，防止二次污染”。

      病原廢水監控的需要。2000 年 6 月由原建設部、國家環保總局、科技部聯合發布的“關于印發《城市污水處理及污染防止技術政策》的通知”中規定：“為保證公共衛生安全，防止傳染性疾病傳播，城市污水處理設施應設置消毒設施”。此外，《城鎮污水處理廠污染的排放標準》(GB l8918-2002)中首次將微生物指標列為基本控制指標，規定污水處理廠出水必須進行消毒處理，從而使我國污水處理標準的病理指標與國際接軌。目前，國內所有的污水處理廠必須設置消毒設施，常見的廢水消毒處理方法見表 1。

表1 廢水消毒方法比較

      病原微生物消毒監控的需要。《病原微生物實驗室生物安全管理條例》、《實驗室生物安全通用要求》（GB 19489）等有關規定，對涉及生物安全的廢水、廢液、廢氣等進行滅活滅菌后才能排放，滅活滅菌方法應符合《消毒技術規范》的規定。《中華人民共和國傳染病防治法》、《病原微生物實驗室生物安全管理條例》（國務院令第 424 號）、《醫院感染管理規范》等法律規范規定：污染物必須進行消毒、滅菌效果定期檢測。常見病原菌滅菌條件見表 2。

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